脑低氧预适应及其机制>复方丹参滴丸对缺血预适应大鼠心肌蛋白激酶C表达的影响(1)天津中医学院中医药研究中心 高秀梅　张伯礼　商洪才王怡　郭利平　张萌　史红　清华大学化学系　刘密新 -------------------------------------------------------------------------------- 摘　要 目的：复方丹参滴丸模拟和加强缺血预适应（IPC）的机制，是否通过促进蛋白激酶C（PKC）蛋白、mRNA水平表达发挥作用。方法：采用结扎大鼠冠脉缺血5 min、再灌注5 min反复循环3次的缺血预适应方案和缺血30 min，再灌注2h的缺血再灌模型，通过免疫组化、RT－PCR的方法观察PKC蛋白、mRNA表达以及复方丹参滴丸对其影响。 结果：PKC在正常对照组中主要存在胞浆，但经过IPC和使用复方丹参滴丸后，在胞膜和胞核也可见；不论早期IPC组，还是晚期IPC组PKC表达均高于假性预处理组，以早期IPC组明显，P< 0.01；经复方丹参滴丸预处理后，PKC的表达均高于再灌注组、早期IPC组、晚期IPC组，以药物预处理＋ 缺血预处理组（DIPC）为优，显著高于早期IPC组，P< 0.01。PKC mRNA在正常心肌组织、再灌注组、假性预处理组间无明显差异，但IPC后不论早期，还是晚期PKC mRNA表达均高于假性预处理组，晚期IPC 组表现更加明显；经复方丹参预处理后，可明显促进早、晚期IPC及再灌注组PKC mRNA的表达，P< 0.05。结论：复方丹参滴丸可激活PKC，使其发生转位，促进其蛋白、mRNA表达水平增高。这可能是复方丹参滴丸模拟和加强IPC的主要机制之一。 (上接本版7月18日第10版) 七、采用RT－PCR方法观察PKC mRNA表达 于实验结束时各组取心尖组织100 mg，立刻放入液氮中保存。 1、总RNA的分离：使用TRIZOL Reagent(LTI)提取心肌总RNA，核酸分析仪定量，检测纯度和含量，琼脂糖凝胶电泳分析其完整性。取1μg RNA用于RT－PCR。 2、一步法RT－PCR：使用TakaRa BIOTECH公司的一步法试剂盒测定。反应体系为25 μl, 每一反应体系中含总RNA 1μg，上游引物和下游引物终浓度为0.4 μmol，PKC RT－PCR扩增循环28次，逆转录50℃、30 min，变性94℃、30s，退火温度为55℃、30s，延伸72℃、6min。β－actin退火温度为64℃，其作用条件同上。 3、PKC mRNA表达分析：各组取0.5 μl扩增产物，进行琼脂糖凝胶电泳，结果拍照，采用Image Master VDS进行光密度扫描（IOD），以各组PKC条带IOD和相应的β－actin条带的IOD比值表示PKC mRNA表达的强弱。 4、统计学处理时数据用x±s表示，用随机设计的方差分析和q检验。采用Stada4.0软件进行。 结　果 1、复方丹参滴丸对IPC大鼠心脏组织PKC蛋白表达的影响 PKC在对照组中主要存在胞浆，但经过IPC和用药后，在胞膜和胞核也可见，这说明IPC和用药两种情况激活了PKC，发生转位，再灌注组和假性预处理组较对照组表达增强， 但差异无显著性；不论早期IPC组，还是晚期IPC组表达均高于假性预处理组，以早期IPC组明显，P< 0.01；经复方丹参滴丸预处理后，PKC的表达均高于相应组，以药物预处理加缺血预处理组为优，显著高于IPC组，P< 0.01。上述结果提示，复方丹参滴丸可激活PKC，促进PKC蛋白表达，见表1。 　 表1　各组PKC表达评分值 -------------------------------------------------------------------------------- 组 例数 评分值 -------------------------------------------------------------------------------- controlIRSIPCIPCDIPCDIRSIPC/SWOPIPC/SWOPDIPC/SWOP 677777767 0.88±0.211.79±0.862.43±1.003.36±1.17＊＊5.2±1.30 ＊＊△△2.71±1.311.25±0.631.83±1.482.71±1.12 -------------------------------------------------------------------------------- 注：与IR、SIPC比较＊＊P< 0.01，与IPC比较△△P< 0.01 2、复方丹参滴丸对IPC大鼠心脏组织PKC mRNA表达的影响 琼脂糖凝胶电泳结果，经光密度分析发现，PKC mRNA在正常心肌组织中也表达，再灌注和假性预处理组与对照组没有明显差异，不论早期IPC组，还是晚期IPC组表达均高于假性预处理组，晚期IPC 组表现更加明显；复方丹参滴丸预处理后，可明显促进早、晚期IPC及再灌注组PKC mRNA的表达，P< 0.05，见图1。 讨　论 PKC广泛分布于多种组织、器官和细胞，在心脏中主要是ε、η亚型,静止细胞中PKC主要存在于胞浆中，当细胞受到刺激后，PKC以钙离子依赖的形式从胞浆中移位到细胞膜上，此过程称之为转位（translocation）。一般将PKC的转位作为PKC激活的标志。PKC的激活依赖于钙离子和磷酯的存在，但只有在磷酯代谢中间产物二酰基甘油（DAG）存在下，生理浓度的钙离子才起作用，这是由于DAG能增加PKC对底物亲和力的缘故。磷酯酰肌醇－4，5－二磷酸（PIP2）在磷酯酶－C作用下水解生成DAG和IP3。IP3促进细胞内钙离子的释放，在激活PKC过程中与DAG起协同作用。 实验证明，非特异性激动剂PMA（phorbol myristate acetate ）直接激活PKC，能与IPC产生一样的保护效果；PKC抑制剂能消除IPC的保护效应，而且能消除KATP通道开放剂介导的缺血预适应效应。因此PKC激活与移位被认为是缺血预适应信号级联反应中的“关键环节”。也有研究显示相反的结论，佛波酯（phorbol esters ）激活PKC出现加重低氧损伤已是事实；这可解释为，动物种属不同、模型不同和拮抗剂不同，结果可能不同。 PKC在IPC中作用机制有两种假说：(1)移位假说(translocation hypothesis)；(2)磷酸化移位假说（phosphorylated translocation hypothesis），即开始由暂时的PKC移位和保护蛋白的磷酸化。IPC开始阶段是PKC由胞浆向胞膜和胞核移位，此阶段也称记忆阶段，记忆阶段是磷酸化蛋白的积累，随PKC移位的消失和磷酸化蛋白的磷解记忆也消失。 IPC的保护主要是由PKC的激活、蛋白质的磷酸化及其保护蛋白的积累。当短暂缺血和药物刺激后PKC迅速转位，使多种保护蛋白发生磷酸化，这是长时间缺血保护的基础。 本实验观察到，IPC和用药后PKC有转位的现象，IPC组PKC mRNA和蛋白表达明显增强，另外，我们还发现不论是再灌注前给予复方丹参滴丸，还是早、晚期IPC前给予复方丹参滴丸，均可明显促进PKC mRNA和蛋白表达水平增高。说明复方丹参滴丸对心脏缺血的保护可能是通过激活PKC途径而起作用。但PKC激活后能使哪些蛋白质发生磷酸化，并参与了心肌细胞的保护作用，以及复方丹参滴丸激活了PKC的何种亚型是今后需要研究的问题。　(全文完)Neuroscience. 2002;110(3):541-54. Related Articles, Links Chemical anoxia activates ATP-sensitive and blocks Ca(2+)-dependent K(+) channels in rat dorsal vagal neurons in situ.Kulik A, Brockhaus J, Pedarzani P, Ballanyi K.II. Physiologisches Institut, Universitat Gottingen, Germany.The contribution of subclasses of K(+) channels to the response of mammalian neurons to anoxia is not yet clear. We investigated the role of ATP-sensitive (K(ATP)) and Ca(2+)-activated K(+) currents (small conductance, SK, big conductance, BK) in mediating the effects of chemical anoxia by cyanide, as determined by electrophysiological analysis and fluorometric Ca(2+) measurements in dorsal vagal neurons of rat brainstem slices. The cyanide-evoked persistent outward current was abolished by the K(ATP) channel blocker tolbutamide, but not changed by the SK and BK channel blockers apamin or tetraethylammonium. The K(+) channel blockers also revealed that ongoing activation of K(ATP) and SK channels counteracts a tonic, spike-related rise in intracellular Ca(2+) ([Ca(2+)]) under normoxic conditions, but did not modify the rise of [Ca(2+)] associated with the cyanide-induced outward current. Cyanide depressed the SK channel-mediated afterhyperpolarizing current without changing the depolarization-induced [Ca(2+)] transient, but did not affect spike duration that is determined by BK channels. The afterhyperpolarizing current and the concomitant [Ca(2+)] rise were abolished by Ca(2+)-free superfusate that changed neither the cyanide-induced outward current nor the associated [Ca(2+)] increase. Intracellular BAPTA for Ca(2+) chelation blocked the afterhyperpolarizing current and the accompanying [Ca(2+)] increase, but had no effect on the cyanide-induced outward current although the associated [Ca(2+)] increase was noticeably attenuated. Reproducing the cyanide-evoked [Ca(2+)] transient with the Ca(2+) pump blocker cyclopiazonic acid did not evoke an outward current.Our results show that anoxia mediates a persistent hyperpolarization due to activation of K(ATP) channels, blocks SK channels and has no effect on BK channels, and that the anoxic rise of [Ca(2+)] does not interfere with the activity of these K(+) channels.Am J Physiol Heart Circ Physiol. 2003 Apr;284(4):H1230-9. Epub 2002 Dec 27. Related Articles, Links Stimulation of perivascular nitric oxide synthesis by oxygen.Thom SR, Fisher D, Zhang J, Bhopale VM, Ohnishi ST, Kotake Y, Ohnishi T, Buerk DG.Department of Emergency Medicine, University of Pennsylvania Medical Center, Philadelphia 19104, USA. [email protected] hypothesized that elevated partial pressures of O(2) would increase perivascular nitric oxide (*NO) synthesis. Rodents with O(2)- and.NO-specific microelectrodes implanted adjacent to the abdominal aorta were exposed to O(2) at partial pressures from 0.2 to 2.8 atmospheres absolute (ATA). Exposures to 2.0 and 2.8 ATA O(2) stimulated neuronal (type I) NO synthase (nNOS) and significantly increased steady-state.NO concentration, but the mechanism for enzyme activation differed at each partial pressure. At both pressures, elevations in.NO concentration were inhibited by the nNOS inhibitor 7-nitroindazole and the calcium channel blocker nimodipine. Enzyme activation at 2.0 ATA O(2) appeared to be due to an altered cellular redox state. Exposure to 2.8 ATA O(2), but not 2.0 ATA O(2), increased nNOS activity by enhancing nNOS association with calmodulin, and an inhibitory effect of geldanamycin indicated that the association was facilitated by heat shock protein 90. Infusion of superoxide dismutase inhibited.NO elevation at 2.8 but not 2.0 ATA O(2). Hyperoxia increased the concentration of.NO associated with hemoglobin. These findings highlight the complexity of oxidative stress responses and may help explain some of the dose responses associated with therapeutic applications of hyperbaric oxygen.间歇性低氧处理大鼠心肌的抗心律失常与抗氧化效应张翼　钟宁　朱海峰　周兆年摘　要: 　 利用结扎在体大鼠冠脉方法研究不同时间间歇性低氧处理对缺血、 再灌注心律失常以及心肌超氧化物歧化酶(SOD)、 丙二醛(MDA)的影响, 并与连续性低氧相比较。实验结果如下: (1) 间歇性低氧(intermittent hypoxia exposure)28 d (IH28)、 42 d (IH42)、 间歇性低氧28 d后1周 (PIH28-1W)、 2周 (PIH28-2W)和连续性低氧 (continued hypoxia exposure) 28 d (CH28)、 42 d (CH42)大鼠, 缺血和再灌注心律失常评分明显低于对照组; (2)IH28、 IH42、 CH28、 CH42、 PIH28-1W、 PIH28-2W及间歇性低氧28 d后3周 (PIH28-3W)大鼠心肌的SOD明显高于对照组; 而间歇性低氧14 d (IH14)、 IH28、 IH42、 CH28、 CH42、 PIH28-1W及PIH28-2W大鼠心肌的MDA明显低于对照组。实验结果表明: 间歇性低氧处理28 d和42 d具有明确的抗缺血和再灌注心律失常作用, 此作用与心肌抗氧化能力增强有关。抗心律失常作用于间歇性低氧处理14 d后逐渐发生, 脱离低氧处理后可有效维持2周左右。关键词: 间歇性低氧; 心律失常; 超氧化物歧化酶、 丙二醛; 适应; 心脏学科分类号: Q463Antiarrhythmic and antioxidative effects of intermittent hypoxia exposure on rat myocardiumZHANG Yi, ZHONG Ning, ZHU Hai-Feng, ZHOU Zhao-Nian(Shanghai Institute of Physiology, Chinese Academy of Sciences，　Shanghai 200031)Abstract: 　 The purpose of the study was to observe the effects of intermittent hypoxia exposure (IH) on the arrhythmia and antioxidation with ligation of coronary artery of rat heart together with measuring SOD (superoxide dismutase) and MDA (malondialdehyde) in myocardium. Comparison with continued hypoxia exposure was also made. The results obtained are as follows. (1) Arrhythmia scores of ischemic arrhythmia and reperfusion arrhythmia observed in the rats treated with IH 28-day (IH28) and 42-day (IH42), one week (IH28-1W) and two weeks (IH28-2W) after 28-day IH, as well as in those with continued hypoxia 28-day (CH28) and 42-day (CH42), were significantly lower than controls. (2) SOD in IH28, IH42, CH28, CH42, IH28-1W, IH28-2W and three weeks after 28-day IH were significantly higher than controls; MDA in IH14, IH28, IH42, CH28, CH42, IH28-1W and IH28-2W were significantly lower than controls. It is suggested that IH for 28 or 42 days has some definite antiarrhythmic effect against ischemia and reperfusion, which was related to the strength of antioxidation in myocardium. The antiarrhythmic effects occurred gradually after 14 days IH and persisted for about two weeks after 28 days IH. Key words: intermittent hypoxia; arrhythmia; SOD; MDA; heart　　近年来,大量实验表明, 间歇性暴露于适当低氧环境可激发机体的适应机制,进而产生有利的影响。间歇性低氧适应具有明显的心脏保护作用, 可减轻应激、 缺血对心肌的损伤, 增强心肌电稳定性及预防和对抗某些心律失常的发生［1］。但有关间歇性低氧抗心律失常的研究甚少, 有关其起效与持续时间未见报道。本研究利用结扎在体大鼠冠脉方法, 研究不同时间间歇性低氧处理对缺血、 再灌注心律失常的影响, 并与连续性低氧相比较。同时测定心肌组织的超氧化物歧化酶(SOD)活力和丙二醛(MDA)含量,以探讨间歇性低氧抗心律失常的机制。1　材料和方法1.1　动物分组及低氧处理　　雄性SD大鼠90只, 初始体重120～150 g, 最后体重220～280 g。随机分为9组: 对照组 (Con, n=12)、 间歇性低氧 (IH)14 d组 (IH14, n=11)、 28 d组 (IH28, n=9)、 42 d组 (IH42, n=11); 间歇性低氧28 d后1周组 (PIH28-1W, n=10)、 2周组 (PIH28-2W, n=8)、 3周组 (PIH28-3W, n=8); 连续性低氧28 d组 (CH28, n=11)与42 d组 (CH42, n=10)。间歇性低氧动物于低压氧舱分别接受14, 28 和42 d 相当5000 m 高原的减压低氧处理, 每天6 h。PIH28-1W、 PIH28-2W和PIH28-3W动物于28 d间歇性低氧后在常氧环境放置1周、 2周和3周再进行实验。连续性低氧动物在低压氧舱给于连续的低氧处理。对照组动物除不接受低氧处理外, 其他条件与低氧动物相同。1.2　手术操作过程　　动物以戊巴比妥钠 (30～35 mg/kg, ip)麻醉, 置于恒温手术台, 保持动物体温于37℃左右。切开颈部, 放置气管插管行人工呼吸 (PH-1型动物人工呼吸机, 浙江医科大学)。血气测定 (ABL3血气分析仪, 丹麦)动脉血氧分压 (PO2)、 血氧饱和度 (SaO2)、 二氧化碳分压 (PCO2)及pH分别为15.0±0.03 kPa, 98.2%±0.08%, 4.76±0.25 kPa 和7.35±0.01。右颈总动脉插管监视血压变化, 针型电极插入肢体皮下记录标准Ⅱ导ECG。通过微机及记录系统 (PowerLab/8 s, 澳大利亚)连续记录动脉血压和ECG。　　于左侧第4～5肋间开胸, 暴露心脏, 剪开心包。于冠状动脉左前降支起始段下方穿一细丝线, 丝线两头套入一细塑料套管, 通过微型扩张器控制丝线的松紧可造成冠脉的阻断和再灌注［1］。结扎和放松冠脉各15 min, 在缺血及再灌注过程中, 观察室性心律失常 (包括室性早搏、 室性心动过速和室颤)的发生情况。心律失常鉴定按Lambeth规定［2］, 心律失常评分 (arrhythmia score, AS)参照 Johnston标准［3］。1.3　心肌SOD和 MDA 的测定　　各组动物实验结束後,迅速取出心脏,称重,制备匀浆。应用邻苯三酚法［4］测定心肌SOD活力。 用Ohkawa法［5］测定MDA含量。2　结果2.1　间歇性低氧减轻缺血、 再灌注心律失常的发生　　IH14大鼠缺血和再灌注心律失常评分分别为2.6±0.5和3.6±0.3, 与对照组4.0±0.7和3.3±0.6比较, 无显著性差异 (P>0.05); IH28、 IH42大鼠缺血和再灌注心律失常评分分别为1.2±0.5, 1.0±0.5和1.0±0.5, 0.9±0.5,明显低于对照组 (P<0.05～0.01, 见图1)。 PIH28-1W, PIH28-2W大鼠的缺血和再灌注心律失常评分分别为0.9±0.4, 1.6±0.4和1.8±0.3, 2.4±0.5, 明显低于对照组 (P<0.05), 而PIH28-3W的评分为2.5±0.7, 3.1±0.4,与对照组无明显差异 (P>0.05, 见图2)。 CH28大鼠缺血和再灌注心律失常评分为1.0±0.5和1.6±0.3; CH42大鼠缺血和再灌注心律失常评分为0.7±0.3, 0.6±0.4; 与对照组相比较, 均具有显著性差异 (P<0.05～0.01, 见图3)。 图　1.　　间歇性低氧处理对大鼠心律失常的影响Fig.1.　Effects of intermittent hypoxia exposure on arrhy thmia induced by ischemia and reperfusion in rats.Mean±SEM,*P<0.05,**P<0.01 vs control. AS: arrhythmia score; IH14: intermittent hypoxia exposure (IH) 14 days; IH28: IH 28 days; IH42: IH 42 days. 图　2.　间歇性低氧处理后大鼠的心律失常Fig.2.　Arrhythmia of rats at 1,2 or 3 weeks after exposure to intermittent hypoxia. Mean±SEM,*P<0.05,**P<0.01 vs control. AS: arrhythmia score; IH28: 28 days intermittent hypoxia exposure; PIH28-1W, PIH28-2W, PIH28-3W: 1, 2 or 3 weeks after IH28. 图　3.　　间歇性低氧与连续性低氧处理大鼠心律失常的比较Fig.3.　Comparison of arrhythmia between IH and CH.Mean±SEM,*P<0.05,**P<0.01 vs control. AS: arrhythmia score; IH28, IH42: 28 and 42 days intermittent hypoxia exposure; CH28, CH42: 28 or 42 days continued hypoxia.2.2　间歇性低氧增强心肌的抗氧化能力　　从表1可以看出, IH28、 IH42、 CH28、 CH42、 PIH28-1W、 PIH28-2W各组大鼠心肌的抗氧化能力比对照组明显增强, 表现为SOD升高, MDA降低。 由表1还可看出IH14大鼠的MDA低于对照组和PIH28-3W大鼠的SOD高于对照组, 说明这两组动物心肌的抗氧化能力也有不同程度增强。表1.　大鼠心脏SOD活性和MDA浓度的变化Table 1.　Changes in SOD activities and MDA concentrations in rat hearts 　 SOD (U/g) MDA (nmol/g) Control 1120±71 182±3 IH 14 1426±66 125±3* IH28 1783±69* 132±5* IH42 1795±45* 137±7* CH28 1603±84* 136±12* CH42 1824±99* 135±4* PIH28-1W 1698±76* 128±7* PIH28-2W 1615±53* 155±16* PIH28-3W 1624±63* 161±10 Mean±SEM,*P<0.05 vs control.IH14,IH28,IH42:14,28 and 42 days intermittent hypoxia exposure;CH28,CH42:28 and 42 days continued hypoxia exposure;PIH28-1W,PIH28-2W,PIH28-3W:1,2 and 3 weeks after IH28.3　讨论　　本实验结果从整体水平进一步证实间歇性低氧处理28 d和42 d具有明确的抗缺血和再灌注心律失常作用［6］,并首次观察了间歇性低氧处理抗心律失常作用的起效和维持时间,发现间歇性低氧处理抗心律失常作用由低氧暴露后约14 d逐渐发生,并在脱离低氧处理后可有效维持2周左右时间。这对进一步研究间歇性低氧处理的心脏保护及抗心律失常作用提供重要的实验依据。我们的研究结果表明28和42 d的间歇性低氧和连续性低氧均具有明显的抗缺血、 再灌注心律失常作用, 与两种低氧作用具有许多相似之处的报道一致［7］。　　心肌缺血再灌注时产生的氧自由基是造成心肌损伤的一个重要因素,也是缺血、 再灌注心律失常产生的重要原因之一［8］。SOD是生物体内清除氧自由基的抗氧化酶系统中的一种重要酶, 而MDA则是自由基连锁反应-脂质过氧化的最终产物,两者的变化可反映心肌的抗氧化能力。本实验结果显示, 间歇性低氧处理可明显增加SOD活性,降低MDA含量, 说明间歇性低氧处理可增强心肌的抗氧化能力,增强心肌对缺血再灌注损伤的耐受程度［9］。抗氧化能力的增强与抗心律失常作用相一致,提示间歇性低氧处理可同时增强心肌抗氧化和抗心律失常作用。心肌抗氧化能力的增强可能是间歇性低氧抗心律失常, 尤其是抗再灌注心律失常的重要机制之一［10］。　　缺血性心律失常是临床常见病症, 严重损害心脏功能, 是引起死亡的重要原因之一。目前使用的各类抗心律失常药物存在各种不同程度的副作用［11］。研究和开发非药物治疗手段是目前医学领域研究的热点之一。连续性的慢性低氧适应也具有心脏保护、 抗心律失常作用。但连续长期低氧引起右室代偿性肥厚又会损害心脏功能, 加重心律失常［12］, 甚至造成慢性高山病。间歇性低氧处理具有明显的心脏保护、 抗心律失常作用, 同时具有方法简便、易于应用、 无明显副作用、 作用维持时间较长等优点。因此, 完全有理由预言: 间歇性低氧处理可作为一种非药物性保护心肌的新途径用于临床, 造福人类。 但间歇性低氧保护作用的机制尚需深入研究。This project was supported by the National Natural Science Foundation of China (No.39500052).Corresponding author. Tel: 64313251-8500; Fax: 64746305; E-mail: [email protected]张翼(中国科学院上海生理研究所, 上海 200031)钟宁(中国科学院上海生理研究所, 上海 200031)朱海峰(中国科学院上海生理研究所, 上海 200031)周兆年(中国科学院上海生理研究所, 上海 200031)参　考　文　献　［1］　Meerson FZ. Adaptation to intermittent hypoxia and its use for protecting the stress and ischemic damage. In Meerson FZ, ed. Adaptative Protection of the Heart:　Protecting Against Stress and Ischemic Damage. Florida:　CRC Press, 1991, 249～284.　［2］　Cerati D, Schwartz PJ. Single cardiac vagal fiber activity, acute myocardial ischemia, and risk for sudden death. Circ Res， 1991, 69: 1389～1401.　［3］　Walker MJA, Curtis MJ, Hearse DJ et al. The Lambeth conventions:　guidelines for the study of arrhythmias in ischemia, infarction, and reperfusion. Cardiovasc Res， 1988, 22: 447～455.　［4］　Johnston KM, Macleod BA， Walker JA. Responses to lig～ation of a coronary artery in conscious rats and the actions of antiarrhythmics. Can J Physiol Pharmacol， 1983, 61: 1340～1353.　［5］　Marklund S, Marklund G. 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Q J Med， 1989, 71 (266): 555～574.Received 1999-08-17　　Revised 1999-10-18治疗急性呼吸衰竭的新方法——液相通气　　急性呼吸衰竭的主要治疗目标是保证动脉血和组织内足够的氧合，提供解决或改善原发病的时间。为了达到这一目的，临床上研究发展了许许多多的治疗模式，如呼气末正压通气(peep)，体外生命支持系统(ecls)，分侧肺通气和反比通气(irv)等，它们在改善肺功能和气体交换，降低机械通气相关肺损伤方面起到一定的作用。但是这些治疗措施是属于支持性的，而不是治疗性的。近年来，大量的研究表明液相通气(liquidventilation)，包括全液相通气和部分液相通气，在改善肺换气功能和减少呼吸机相关肺损伤方面有突出优点，是治疗急性呼吸衰竭的极有前景的治疗手段之一。本文就有关部分液相通气的研究作一综述如下。 1　液相通气的概况 1.1　液相通气的发展历史本世纪20年代，有研究者用大量生理盐水灌洗肺部以治疗毒气中毒患者。1962年，kylstra和tissing在一篇题为“小鼠变鱼”的文章中提出了液相通气的概念。1966年，clark和gollen观察了自主呼吸小鼠分别呼吸高压盐水和全氟碳后完成气体交换的能力。这项研究一经在《science》上发表，就揭开液相通气研究的序幕。之后，大量报导了液相通气改善气体交换和肺功能的动物实验研究，主要集中于早产和新生儿模型，也有成年动物的急性肺损伤模型。greenspan及其同事于1990年首次报导了液相通气的临床应用。作者治疗了3例对表面活性蛋白疗效差而濒死的早产儿。此后，在1991年，fuhrman及其同事简化了液相通气治疗模式，将常规机械通气全氟碳的气道内应用结合起来，由此发展了全氟碳相关气体交换(perfluorocarbon-associatedgasexchange,page)技术，即以后所谓的部分液相通气(partialliquidventilation,plv)。他们的研究表明部分液相通气完全可以为健康动物提供足够的气体交换。由于部分液相通气在技术上简便易行，实验治疗确实可靠，采用部分液相通气治疗急性呼吸衰竭的研究迅速成为热点。1996年，hirschlrb等首先报导了液相通气在成人急性呼吸窘迫综合征中的临床应用。1.2　高氟溴碳的医学应用特点　　近年来广泛用于液相通气医学实验及临床研究的介质是美国alliance医药公司(alliancepharmaceutialcorp)研制的perflubron(perfluorooctylbromide,liquivent)，其分子式为c8f17brl，是一个八碳链，八个碳原子除在末端接一个溴原子外，其余所有可能的部位均连接着氟原子。惰性材料，无色，与水相溶，25℃时比重为1.918g/ml。表面张力低，为18.1dyne/cm。粘度低，蒸发性低。该材料可溶解大量的氧气和二氧化碳，在37℃和一个大气压时，溶解度分别为530ml/l和2100ml/l。高氟溴碳不透射线，几乎不被人体吸收，故临床上很容易判断其在肺内的充盈程度和分布，此外，在一定程度上起到气道造影剂的作用，有助于观察胸腔积液、气胸、肺气肿、肺不张等疾病。然而，这一特性也会使判断浸润性肺疾患的性质和判断胸腔内置管的位置变得困难。1.3　部分液相通气与全液相通气的区别一般文献中所称的液相通气就是指全液相通气，它是指在整个通气回路中充满了液体。1991年，发展了部分液相通气，是指在肺内注入相当于功能残气量的液体，并结合常规机械通气进行通气治疗，又称全氟碳相关气体交换(page)。两者的比较见附表。　　　　　　　部分液相通气　　　　　　　　　　　全液相通气通气介质功能残气量的液体加潮气量的气体　　　　　全部为液体通气机器　　　普通呼吸机　　　　　　　　　　　特殊液体呼吸机氧合方式　含氧气体直接吹入液体中　　　　　　　液体在体外循环氧合综合评价　　　简便，易推广　　　　　　　　　　复杂，技术要求高附表　部分液相通气与全液相通气的区别 2　有关液相通气的实验研究液相通气的实验研究集中在急性呼吸衰竭的治疗。其模型分为两大类，一类是模拟婴幼儿的急性呼吸衰竭，另一类是模拟成年人的急性呼吸衰竭，前者在病因学上突出强调肺表面活性蛋白的缺乏，后者的病因学则复杂的多，包括急性呼吸窘迫综合征(ards)和各种各样的肺炎等。比较典型的模型有早产胎羊急性呼衰、新生小猪胃酸误吸、兔盐水肺内灌洗、狗油酸右心房注射、羊盐水肺内灌洗加油酸右心房注射〔16～20〕等。尽管急性呼吸衰竭的动物模型多种多样，其基本的病理及病理生理改变特点仍主要为：①肺静态和动态顺应性降低。②血气分析的改变，包括低氧血症，伴有或不伴有高碳酸血症。③肺内分流增加。④局部呈充血、水肿、炎性改变。大量的实验研究表明，采用高氟溴碳的液相通气或部分液相通气对急性呼吸衰竭有多种治疗作用，表现在①肺的动态和静态顺应性显著升高，气道内峰压和平台压降低，既而气压伤发生率下降。②气体交换障碍改善，低氧血症和高碳酸血症得以显著纠正。③肺内生理分流降低。④病理学检查提示局部炎症程度明显降低。对于高氟溴碳液相通气治疗急性呼吸衰竭的机理可能有如下几点。2.1　降低肺泡表面张力急性呼吸衰竭时常伴有肺泡表面活性物质系统的破坏(这一点在婴儿呼吸窘迫综合征中常是最重要的原因)，肺泡表面张力异常升高，部分肺泡不张，导致换气障碍和通气障碍。常规机械通气治疗，要使闭合的肺泡张开，常使用高压手段，这样就不可避免地会引发气压伤和血流动力学状态不稳。很早以前，就有学者发现氟碳液体充盈的肺内，肺泡表面张力是空气充盈时的一半。液相通气时，高氟溴碳注入气道使原来的气/液界面变为液/液界面，加上该材料本身具有较低的表面张力，故可直接降低肺泡表面张力，实践中发现，这种作用起效非常迅速，通常在注入高氟溴碳后数分钟内见效。此外，有研究表明，成年人的急性呼吸衰竭时，肺泡内炎性渗出可使表面活性蛋白灭活失效，使外源性的表面活性蛋白治疗疗效不佳。液相通气有助于清除炎性渗出物，维持表面活性蛋白的作用。steinhom-dm等尚发现液相通气可使表面活性蛋白的磷脂合成及分泌增加。肺泡表面张力降低后，肺的动态和静态顺应性升高，气道峰压和气道平均压下降，既保证了足够的气体交换，又可避免气压伤和血液动力学紊乱的出现，达到治疗目的。2.2　使病变肺泡复张，恢复功能液相通气使肺泡表面张力下降，同时清除了一些炎性渗出物，使原来萎陷的肺泡张开，换气面积增加，通气血流比改善，肺内分流下降，肺换气功能在气道压力不高的情况下就能得到极大的改善，表现在血气分析上，血氧分压较治疗前显著上升，血二氧化碳分压显著下降。由于高氟溴碳是一种几乎不可压缩的液体，有一定的静水压力，萎陷的肺泡张开后不会再萎陷。同时，大量的肺泡复张后，整个肺的顺应性也会升高，这是由于肺的顺应性与肺内可利用肺泡的量成正比。2.3　高氧和二氧化碳溶解度高氟溴碳可以溶解大量的氧气和二氧化碳，足以维持气体交换之需。2.4　局部消炎作用有许多学者研究发现，液相通气治疗急性呼吸衰竭时，有一点与以往的机械通气治疗不同，就是它可显著降低肺病变局部的炎症程度，病理显示局部出血、肺泡积液和炎性浸润显著减少。液相通气可直接改善肺的病理生理状态。高氟溴碳液相通气有局部消炎作用的机理尚不清楚，这方面的研究不多。smithtm等研究发现高氟溴碳在体外可抑制肺泡巨噬细胞对异物的反应性，这可部分解释液相通气的消炎作用。 3　液相通气的临床研究　　自1990年报导以来，液相通气的临床研究逐渐谨慎地有所开展，总体病例数较少，主要集中在美国的纽约州立大学附属医院和密歇根大学附属医院。前者以clleach为首，后者以rbhirschl为首。前者的研究对象集中在婴幼儿，治疗时不需要ecls。后者的研究对象较广，目前治疗仍需在ecls基础上进行。目前用于临床的均为部分液相通气。从目前有限的临床研究来看，液相通气治疗急性呼吸衰竭，可显著改善肺顺应性和换气功能，可用于各种急性呼吸衰竭的治疗。 4　液相通气的并发症　　近年来的动物实验结果均未发现液相通气有明显的并发症，而目前的临床研究均无对照，已发现的可能与液相通气有关的并发症有气胸、痰栓阻塞等。对此，今后尚需进一步观察研究。综上所述，液相通气是近30年来发展起来的以液性氟碳化合物作为通气介质的新技术，在治疗急性呼吸衰竭方面正越来越成为研究热点。液相通气分全液相通气和部分液相通气两种，后者又称氟碳相关气体交换，是在前者的基础上简化而来，更易推广使用。目前研究发现液相通气可显著提高肺顺应性，改善换气功能，降低气压伤发生率，并有局部直接消炎作用。液相通气的临床研究正逐步谨慎地开展。这里有些文献是说NO与适应的关系，总结如下：Stroke. 2003 May;34(5):1299-303. Epub 2003 Apr 03. Related Articles, Links Rapid cerebral ischemic preconditioning in mice deficient in endothelial and neuronal nitric oxide synthases.Atochin DN, Clark J, Demchenko IT, Moskowitz MA, Huang PL.Cardiology Division, Cardiovascular Research Center, Massachusetts General Hospital East, Charlestown, MA 02129, USA.BACKGROUND AND PURPOSE: The purpose of this study was to test the hypothesis that nitric oxide is required for preconditioning in an intact animal model of focal ischemia using neuronal and endothelial nitric oxide synthase (nNOS and eNOS) knockout mice. METHODS: Cerebral blood flow was measured in wild-type, nNOS knockout, and eNOS knockout mice by hydrogen clearance (absolute) and laser Doppler flowmetry (relative). Mice were preconditioned by three 5-minute episodes of transient middle cerebral artery occlusion (MCAO) and subjected to permanent MCAO. Neurological deficit and infarct size were determined 24 hours later. RESULTS: Although wild-type mice showed protection from ischemic preconditioning, neither eNOS nor nNOS knockout mice showed protection. Laser Doppler measurements indicated that the relative blood flow decreases in core ischemic areas were the same in all groups. CONCLUSIONS: Neither eNOS nor nNOS knockout mice show protection from rapid ischemic preconditioning, suggesting that nitric oxide may play a role in the molecular mechanisms of protection. Neurobiol Dis. 1996 Feb;3(1):64-71. Related Articles, Links Neonatal mice lacking neuronal nitric oxide synthase are less vulnerable to hypoxic-ischemic injury.Ferriero DM, Holtzman DM, Black SM, Sheldon RA.Department of Neurology, University of California at San Francisco 94143, USA.We hypothesized that elimination of neuronal nitric oxide synthase (nNOS) by targeted disruption of the nNOS gene would result in amelioration of damage seen after hypoxia-ischemia in the developing brain since nitric oxide (NO) has been implicated in glutamate-mediated neurotoxicity after ischemia. Both wildtype and nNOS-deficient pups were subjected to focal ischemia followed by 1.5 h of hypoxia at Postnatal Day 7. Seven days later, brains of surviving animals were analyzed for damage. The nNOS-deficient pups (n = 17) had less histopathologic evidence of injury in both the hippocampus (P = 0.008) and the cortex (P = 0.0008) than the wildtype (n = 30) mice. When injured, the nNOS-deficient mice had damage that was limited to the hippocampus. These results support a role for neuronally produced NO in injury after perinatal hypoxia-ischemia. Biochim Biophys Acta. 1999 Sep 20;1455(1):23-34. Related Articles, Links Role of neuronal and endothelial nitric oxide synthase in nitric oxide generation in the brain following cerebral ischemia.Wei G, Dawson VL, Zweier JL.Department of Medicine, Johns Hopkins University School of Medicine, Johns Hopkins Bayview Medical Center, Baltimore, MD 21224, USA.Nitric oxide (NO) plays an important role in the pathogenesis of neuronal injury during cerebral ischemia. The endothelial and neuronal isoforms of nitric oxide synthase (eNOS, nNOS) generate NO, but NO generation from these two isoforms can have opposing roles in the process of ischemic injury. While increased NO production from nNOS in neurons can cause neuronal injury, endothelial NO production from eNOS can decrease ischemic injury by inducing vasodilation. However, the relative magnitude and time course of NO generation from each isoform during cerebral ischemia has not been previously determined. Therefore, electron paramagnetic resonance spectroscopy was applied to directly detect NO in the brain of mice in the basal state and following global cerebral ischemia induced by cardiac arrest. The relative amount of NO derived from eNOS and nNOS was accessed using transgenic eNOS(-/-) or nNOS(-/-) mice and matched wild-type control mice. NO was trapped using Fe(II)-diethyldithiocarbamate. In wild-type mice, only small NO signals were seen prior to ischemia, but after 10 to 20 min of ischemia the signals increased more than 4-fold. This NO generation was inhibited more than 70% by NOS inhibition. In either nNOS(-/-) or eNOS(-/-) mice before ischemia, NO generation was decreased about 50% compared to that in wild-type mice. Following the onset of ischemia a rapid increase in NO occurred in nNOS(-/-) mice peaking after only 10 min. The production of NO in the eNOS(-/-) mice paralleled that in the wild type with a progressive increase over 20 min, suggesting progressive accumulation of NO from nNOS following the onset of ischemia. NOS activity measurements demonstrated that eNOS(-/-) and nNOS(-/-) brains had 90% and < 10%, respectively, of the activity measured in wild type. Thus, while eNOS contributes only a fraction of total brain NOS activity, during the early minutes of cerebral ischemia prominent NO generation from this isoform occurs, confirming its importance in modulating the process of ischemic injury. Neurosci Lett. 2001 Feb 16;299(1-2):130-4. Related Articles, Links Chemical preconditioning in mice is not mediated by upregulation of nitric oxide synthase isoforms.von Arnim CA, Timmler M, Ludolph AC, Riepe MW.Department of Neurology, University of Ulm, Steinhovelstrasse 1, 89075 Ulm, Germany.Ischemic preconditioning requires increased nitric oxide (NO) production. However, NO may also trigger delayed neuronal death cascades. The goal therefore was to investigate nitric oxide synthase (NOS) isoforms (neuronal NOS: nNOS; endothelial NOS: eNOS; inducible NOS: iNOS) with reverse transcriptase-polymerase chain reaction in hippocampal slices from control mice and slices prepared upon preconditioning in vivo (single intraperitoneal injection of 20 mg/kg body weight 3-nitropropionate (3NP)). One hour after preconditioning nNOS (108+/-34%, mean+/-SD), eNOS (93+/-34%), and iNOS (282+/-261%) remained at control levels. Similarly, nNos, eNOS, and iNOS stayed at control level 12, 24, and 72 h after preconditioning with 3NP. Incubation of slices, however, drastically increased iNOS (1676+/-818, P<0.01). We conclude that chemical preconditioning other than ischemic preconditioning may not increase potentially harmful nitric oxide synthase isoforms. Brain Res. 2000 Jul 28;872(1-2):215-8. Related Articles, Links Gene-dosing effect and persistence of reduction in ischemic brain injury in mice lacking inducible nitric oxide synthase.Zhao X, Haensel C, Araki E, Ross ME, Iadecola C.Center for Clinical and Molecular Neurobiology, Departments of Neurology and Neuroscience, University of Minnesota Medical School, Minneapolis, MN 55455, USA.We investigated whether the reduction in ischemic brain injury in inducible nitric oxide synthase (iNOS) null mice is related to the iNOS gene copy number, and whether such protection is long lasting. The middle cerebral artery (MCA) was occluded in heterozygous (+/-) and homozygous (-/-) iNOS null mice, as well as in wild-type littermates (iNOS +/+). Four days after MCA occlusion, total infarct volume was reduced by 29% in iNOS -/- mice (n=6; P<0.05) and by 14% in iNOS+/-mice (n=8; P<0.05), compared to iNOS +/+ (n=8). Ten days after MCA occlusion, total infarct volume was still reduced in iNOS +/- (-14%) and -/- mice (-21%; P<0.05 from iNOS +/+; n=8/group). These data indicate that the reduction in infarct volume is greater in iNOS -/- than in iNOS +/- mice and that the effect is stable in time. We conclude that the reduction in ischemic damage conferred by iNOS deletion exhibits a gene-dosing effect and that the protection is long lasting.Science. 1994 Sep 23;265(5180):1883-5. Related Articles, Links Effects of cerebral ischemia in mice deficient in neuronal nitric oxide synthase.Huang Z, Huang PL, Panahian N, Dalkara T, Fishman MC, Moskowitz MA.Stroke Research Laboratory, Massachusetts General Hospital, Charlestown 02129.The proposal that nitric oxide (NO) or its reactant products mediate toxicity in brain remains controversial in part because of the use of nonselective agents that block NO formation in neuronal, glial, and vascular compartments. In mutant mice deficient in neuronal NO synthase (NOS) activity, infarct volumes decreased significantly 24 and 72 hours after middle cerebral artery occlusion, and the neurological deficits were less than those in normal mice. This result could not be accounted for by differences in blood flow or vascular anatomy. However, infarct size in the mutant became larger after endothelial NOS inhibition by nitro-L-arginine administration. Hence, neuronal NO production appears to exacerbate acute ischemic injury, whereas vascular NO protects after middle cerebral artery occlusion. The data emphasize the importance of developing selective inhibitors of the neuronal isoform. Stroke. 2002 Nov;33(11):2704-10. Related Articles, Links Transient focal ischemia increases endothelial nitric oxide synthase in cerebral blood vessels.Veltkamp R, Rajapakse N, Robins G, Puskar M, Shimizu K, Busija D.Department of Physiology and Pharmacology and Center for Investigative Neuroscience, Wake Forest University School of Medicine, Winston-Salem, NC, USA. [email protected] AND PURPOSE: Production of NO by endothelial NO synthase (eNOS) plays a protective role in cerebral ischemia. We studied the effects of transient focal ischemia on eNOS expression. METHODS: Wistar rats (n=72) underwent reversible filament occlusion of the right middle cerebral artery for 75 minutes. After 6, 24, 72, or 168 hours of reperfusion, brains were removed and coronal sections cut for eNOS immunohistochemistry, eNOS-alkaline phosphatase costaining, and hematoxylin-eosin staining. Samples for eNOS immunoblots were taken from corresponding striatum and overlying parietal cortex bilaterally. RESULTS: eNOS protein occurred in virtually all blood vessels and was consistently increased in microvessels in the ischemic striatum after 24 to 168 hours of reperfusion but not at 6 hours. eNOS upregulation in the parietal cortex was only present in animals with evidence of cortical infarcts documented on adjacent HE-stained sections. Costaining of endogenous alkaline phosphatase and eNOS demonstrated eNOS expression in all segments of cerebral microvessels. Quantitative analysis of eNOS immunostaining and immunoblots showed no attenuated increase in animals that were treated with indomethacin (5 mg/kg IP), NS398 (20 mg/kg IP), or L-arginine-methyl ester (10 mg/kg IP). In contrast to eNOS, levels of brain NOS did not increase after ischemia. CONCLUSION: eNOS protein is upregulated in pre- and postcapillary microvessels and upregulation appears slower after transient compared with permanent ischemia. Cyclooxygenase and NOS products do not play a major role in postischemic eNOS induction. J Neurosci. 1997 Dec 1;17(23):9157-64. Related Articles, Links Delayed reduction of ischemic brain injury and neurological deficits in mice lacking the inducible nitric oxide synthase gene.Iadecola C, Zhang F, Casey R, Nagayama M, Ross ME.Department of Neurology, University of Minnesota, Minneapolis, Minnesota 55455, USA.Inducible nitric oxide synthase (iNOS), an enzyme that produces toxic amounts of nitric oxide, is expressed in a number of brain pathologies, including cerebral ischemia. We used mice with a null mutation of the iNOS gene to study the role of iNOS in ischemic brain damage. Focal cerebral ischemia was produced by occlusion of the middle cerebral artery (MCA). In wild-type mice, iNOS mRNA expression in the post-ischemic brain begun between 24 and 48 hr peaked at 96 hr and subsided 7 d after MCA occlusion. iNOS mRNA induction was associated with expression of iNOS protein and enzymatic activity. In contrast, mice lacking the iNOS gene did not express iNOS message or protein after MCA occlusion. The infarct and the motor deficits produced by MCA occlusion were smaller in iNOS knockouts than in wild-type mice (p < 0.05). Such reduction in ischemic damage and neurological deficits was observed 96 hr after ischemia but not at 24 hr, when iNOS is not yet expressed in wild-type mice. The decreased susceptibility to cerebral ischemia in iNOS knockouts could not be attributed to differences in the degree of ischemia or vascular reactivity between wild-type and knockout mice. These findings indicate that iNOS expression is one of the factors contributing to the expansion of the brain damage that occurs in the post-ischemic period. iNOS inhibition may provide a novel therapeutic strategy targeted specifically at the secondary progression of ischemic brain injury.Br J Pharmacol. 2001 Sep;134(2):305-12. Related Articles, Links Neuronal nitric oxide synthase (NOS) regulates leukocyte-endothelial cell interactions in endothelial NOS deficient mice.Sanz MJ, Hickey MJ, Johnston B, McCafferty DM, Raharjo E, Huang PL, Kubes P.Immunology Research Group, University of Calgary, Calgary, Alberta T2N 4N1, Canada. [email protected]. The present study was designed to examine the possible role of neuronal nitric oxide synthase (nNOS) in regulation of leukocyte - endothelial cell interactions in the absence of endothelial nitric oxide synthase (eNOS), using intravital microscopy of the cremasteric microcirculation of eNOS(-/-) mice. 2. Baseline leukocyte rolling and adhesion revealed no differences between wild-type and eNOS(-/-) mice in either the cremasteric or intestinal microcirculations. 3. Superfusion with L-NAME (100 microM) caused a progressive and significant increase in leukocyte adhesion in both wild-type and eNOS(-/-) mice, without detecting differences between the two strains of mice. 4. Superfusion with 7-nitroindazole (100 microM), a selective inhibitor of nNOS, had no effect on leukocyte adhesion in wild-type animals. However, it increased leukocyte adhesion significantly in eNOS(-/-) mice, which was reversed by systemic L-arginine pre-administration. 5. Stimulation of the microvasculature with H(2)O(2) (100 microM) induced a transient elevation in leukocyte rolling in wild-type mice. Conversely, the effect persisted during the entire 60 min of experimental protocol in eNOS(-/-) mice either with or without 7-nitroindazole. 6. Semi-quantitative analysis by RT - PCR of the mRNA for nNOS levels in eNOS(-/-) and wild-type animals, showed increased expression of nNOS in both brain and skeletal muscle of eNOS(-/-) mice. 7. In conclusion, we have demonstrated that leukocyte-endothelial cell interactions are predominantly modulated by eNOS isoform in postcapillary venules of normal mice, whereas nNOS appears to assume the same role in eNOS(-/-) mice. Interestingly, unlike eNOS there was insufficient NO produced by nNOS to overcome leukocyte recruitment elicited by oxidative stress, suggesting that nNOS cannot completely compensate for eNOS. Neurol Med Chir (Tokyo). 2001 Feb;41(2):63-72; discussion 72-3. Related Articles, Links Time course of expression of three nitric oxide synthase isoforms after transient middle cerebral artery occlusion in rats.Niwa M, Inao S, Takayasu M, Kawai T, Kajita Y, Nihashi T, Kabeya R, Sugimoto T, Yoshida J.Department of Neurosurgery, Nagoya University School of Medicine, Nagoya, Japan.The involvement of nitric oxide synthase (NOS) in ischemia was evaluated by detecting the expression of neuronal NOS (nNOS), endothelial NOS (eNOS), and inducible NOS (iNOS) by the immunohistochemical method in the rat model of middle cerebral artery (MCA) occlusion. Transient MCA occlusion (2 hours) was induced in 32 male Wistar rats by extracranial insertion of a 3-0 nylon thread through the internal carotid artery into the MCA. Animals were killed at 0, 6, 24, 72, and 168 hours after MCA occlusion (n = 6, 6, 8, 6, and 6, respectively). The brains were fixed with periodate-lysine-paraformaldehyde, frozen, and sectioned. Sections were stained with polyclonal antibody against nNOS, eNOS, and iNOS. Each section was evaluated by microscopic observation (x100). The number of nNOS-positive neurons was 41.6 +/- 5.8 (mean +/- SD) in the control hemisphere. nNOS was upregulated in the ischemic hemisphere (88.3 +/- 18.9), especially in the border zone at 6 hours after MCA occlusion. However, the number decreased to 36.4 +/- 3.6 and 26.3 +/- 7.3 in the ischemic hemisphere after 72 and 168 hours, respectively. eNOS immunoreactivity was present in the endothelium of major vessels at each time point. eNOS was not detected in the microvessels before ischemia, but faint staining was found in the endothelium at 6 hours after MCA occlusion. Immunostaining became more intense thereafter. Faint iNOS immunoreactivity was seen in the microvessels at 6 hours after MCA occlusion. Macrophages in the ischemic core and astrocytes in the border zone showed immunoreactivity to iNOS at 72 and 168 hours after MCA occlusion. Three types of NOS must be related to different stages of ischemic brain damage. nNOS may be neurotoxic in ischemia in the early phase, like iNOS in the late phase. On the other hand, eNOS seemed to be neuroprotective in all stages. These observations suggest the necessity for tailored therapeutic intervention against NOS isoforms at each stage in patients with ischemic stroke. Neuroreport. 2001 Jun 13;12:1663-9. Related Articles, Links Cerebral protection by hypoxic preconditioning in a murine model of focal ischemia-reperfusion.Miller BA, Perez RS, Shah AR, Gonzales ER, Park TS, Gidday JM.Department of Neurosurgery, Washington University School of Medicine, St. Louis, MO 63110, USA.Sublethal periods of hypoxia or ischemia can induce adaptive mechanisms to protect against subsequent lethal ischemic insults in a process known as ischemic preconditioning. In the present study, we developed a murine model of cerebral preconditioning using several common strains of adult mice. Animals were exposed to sublethal hypoxia (11% oxygen for 2 h) 48 h prior to a 90 min period of transient focal middle cerebral artery occlusion, induced by an intraluminal filament; injury was assessed 24 h later by TTC staining. Infarct volume in hypoxia-preconditioned animals was reduced 46%, 58%, and 64% in C57Bl/6, 129SvEv, and Swiss-Webster ND4 mice relative to their respective untreated controls. This non-invasive murine model of ischemic tolerance should be useful for elucidating the molecular basis of this protection using transgenic and knockout mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 1999 Sep 28;96(20):11507-12. Related Articles, Links Comment in: Proc Natl Acad Sci U S A. 1999 Sep 28;96(20):10953-4. The late phase of ischemic preconditioning is abrogated by targeted disruption of the inducible NO synthase gene.Guo Y, Jones WK, Xuan YT, Tang XL, Bao W, Wu WJ, Han H, Laubach VE, Ping P, Yang Z, Qiu Y, Bolli R.Experimental Research Laboratory, Division of Cardiology, University of Louisville, Louisville, KY 40292, USA.The goal of this study was to interrogate the role of inducible NO synthase (iNOS) in the late phase of ischemic preconditioning (PC) in vivo. A total of 321 mice were used. Wild-type mice preconditioned 24 h earlier with six cycles of 4-min coronary occlusion/4-min reperfusion exhibited a significant (P < 0.05) increase in myocardial iNOS protein content, iNOS activity (assessed as calcium-independent L-citrulline formation), and nitrite + nitrate tissue levels. In contrast, endothelial NOS protein content and calcium-dependent NOS activity remained unchanged. No immunoreactive neuronal NOS was detected. When wild-type mice were preconditioned 24 h earlier with six 4-min occlusion/4-min reperfusion cycles, the size of the infarcts produced by a 30-min coronary occlusion followed by 24 h of reperfusion was reduced markedly (by 67%; P < 0.05) compared with sham-preconditioned controls, indicating a late PC effect. In contrast, when mice homozygous for a null iNOS allele were preconditioned 24 h earlier with the same protocol, infarct size was not reduced. Disruption of the iNOS gene had no effect on early PC or on infarct size in the absence of PC. These results demonstrate that the late phase of ischemic PC is associated with selective up-regulation of iNOS, and (ii) targeted disruption of the iNOS gene completely abrogates the infarct-sparing effect of late PC (but not of early PC), providing unequivocal molecular genetic evidence for an obligatory role of iNOS in the cardioprotection afforded by the late phase of ischemic PC. Thus, this study identifies a specific protein that mediates late PC in vivo. Cardiovasc Res. 2002 Feb 1;53(2):405-13. Related Articles, Links Nitric oxide as a mediator of delayed pharmacological (A(1) receptor triggered) preconditioning; is eNOS masquerading as iNOS?Bell RM, Smith CC, Yellon DM.The Hatter Institute and Centre for Cardiology (Division of Medicine), University College London Medical School and Hospitals, Grafton Way, London WC1E 6DB, UK. [email protected]: Nitric oxide (NO), synthesised from the inducible isoform of nitric oxide synthase (iNOS), is implicated in mediating second window of protection (SWOP)/delayed ischemic preconditioning. However the role of NO and iNOS in delayed pharmacological protection remains unclear and is the subject of this investigation. METHODS: To test the hypothesis that iNOS is necessary for delayed pharmacological preconditioning, the adenosine A(1) receptor agonist, 2-chloro N cyclopentyl adenosine (CCPA) (25 microg/kg i.v.) or saline was administered to wild type (WT) or iNOS gene knockout mice (KO). Twenty-four hours later, the hearts were isolated, Langendorff perfused and subjected to 35 min ischemia/30 min reperfusion prior to infarct size determination. RESULTS: WT and KO control hearts had identical infarct sizes of 37 +/- 3% and 37 +/- 2%, respectively. CCPA significantly reduced infarct size in WT hearts to 22 +/- 2% and also, unexpectedly, in KO hearts (27 +/- 2%). This protection was abrogated with the non-specific NOS inhibitor, N(omega) nitro L-arginine methyl ester (L-NAME, 100 microM), and could be mimicked in naive hearts with the NO donor, donor S-nitroso N-acetyl DL penicillamine (SNAP, 1 microM). Delayed protection appeared to be mediated by NO synthesis in both WT and KO hearts. Additional studies using Western blot analysis demonstrated endothelial NOS (eNOS) upregulation and increased NO release in both WT and KO hearts. CONCLUSIONS: This is the first study to demonstrate a role for eNOS in delayed A(1) receptor triggered (pharmacological) preconditioning, potentially representing a new pharmacological target for protecting the ischemic heart. J Cereb Blood Flow Metab. 1999 Mar;19(3):331-40. Related Articles, Links Nitric oxide mediates cerebral ischemic tolerance in a neonatal rat model of hypoxic preconditioning.Gidday JM, Shah AR, Maceren RG, Wang Q, Pelligrino DA, Holtzman DM, Park TS.Department of Neurosurgery, Washington University School of Medicine, St. Louis, Missouri 63110, USA.Neuroprotection against cerebral ischemia can be realized if the brain is preconditioned by previous exposure to a brief period of sublethal ischemia. The present study was undertaken to test the hypothesis that nitric oxide (NO) produced from the neuronal isoform of NO synthase (NOS) serves as a necessary signal for establishing an ischemia-tolerant state in brain. A newborn rat model of hypoxic preconditioning was used, wherein exposure to sublethal hypoxia (8% oxygen) for 3 hours renders postnatal day (PND) 6 animals completely resistant to a cerebral hypoxic-ischemic insult imposed 24 hours later. Postnatal day 6 animals were treated 0.5 hour before preconditioning hypoxia with the nonselective NOS inhibitor L-nitroarginine (2 mg/kg intraperitoneally). This treatment, which resulted in a 67 to 81% inhibition of calcium-dependent constitutive NOS activity 0.5 to 3.5 hours after its administration, completely blocked preconditioning-induced protection. However, administration of the neuronal NOS inhibitor 7-nitroindazole (40 mg/kg intraperitoneally) before preconditioning hypoxia, which decreased constitutive brain NOS activity by 58 to 81%, was without effect on preconditioning-induced cerebroprotection, as was pretreatment with the inducible NOS inhibitor aminoguanidine (400 mg/kg intraperitoneally). The protective effects of preconditioning were also not blocked by treating animals with competitive [3-(2-carboxypiperazin-4-yl)propyl-1-phosphonate; 5 mg/kg intraperitoneally] or noncompetitive (MK-801; 1 mg/kg intraperitoneally) N-methyl-D-aspartate receptor antagonists prior to preconditioning hypoxia. These findings indicate that NO production and activity are critical to the induction of ischemic tolerance in this model. However, the results argue against the involvement of the neuronal NOS isoform, activated secondary to a hypoxia-induced stimulation of N-methyl-D-aspartate receptors, and against the involvement of the inducible NOS isoform, but rather suggest that NO produced by the endothelial NOS isoform is required to mediate this profound protective effect. J Cereb Blood Flow Metab. 2003 Oct;23(10):1219-26. Related Articles, Links Contributions of endothelial and neuronal nitric oxide synthases to cerebrovascular responses to hyperoxia.Atochin DN, Demchenko IT, Astern J, Boso AE, Piantadosi CA, Huang PL.Cardiovascular Research Center, Massachusetts General Hospital, Charlestown, Massachusetts 02129, USA.Hyperoxia causes a transient decrease in CBF, followed by a later rise. The mediators of these effects are not known. We used mice lacking endothelial or neuronal nitric oxide synthase (NOS) isoforms (eNOS-/- and nNOS-/- mice) to study the roles of the NOS isoforms in mediating changes in cerebral vascular tone in response to hyperoxia. Resting regional cerebral blood flow (rCBF) did not differ between wild type (WT), eNOS-/- mice, and nNOS-/- mice. eNOS-/- mice showed decreased cerebrovascular reactivities to NG-nitro-L-arginine methyl ester (L-NAME), PAPA NONOate, acetylcholine (Ach), and SOD1. In response to hyperbaric oxygen (HBO2) at 5 ATA, WT and nNOS-/- mice showed decreases in rCBF over 30 minutes, but eNOS-/- mice did not. After 60 minutes HBO2, rCBF increased more in WT mice than in eNOS-/- or nNOS-/- mice. Brain NO-metabolites (NOx) decreased in WT and eNOS-/- mice within 30 minutes of HBO2, but after 45 minutes, NOx rose above control levels, whereas they did not change in nNOS-/- mice. Brain 3NT increased during HBO2 in WT and eNOS-/- but did not change in nNOS-/- mice. These results suggest that modulation of eNOS-derived NO by HBO2 is responsible for the early vasoconstriction responses, whereas late HBO2-induced vasodilation depends upon both eNOS and nNOS.低氧生理学与高原医学研究 （上）    香山科学会议于2001年6月26日至29日在北京召开了以“低氧生理学与高原医学研究”为主题的第166次学术讨论会。来自中国科学院、军事医学科学院、第三军医大学、中国医学科学院、以及北京、上海、广州、西安、西藏、青海、浙江、湖北、海南、台湾、香港、等省、区、市的科研院所和美国的华人学者共四十多位科学家会聚在北京香山，围绕如何在中国深入开展低氧生理学与高原医学研究这一主题畅所欲言，进行了热烈的讨论。探讨了低氧生理学与高原医学的若干前沿和研究热点，提出了许多具有指导性的科学问题、研究方法及具体建议。 香山科学会议聘请刘东生院士、周兆年研究员、吴天一教授、吕永达研究员担任本次会议的执行主席。刘东生院士于会议开幕式上作了接触高山低氧和高原医学几十年的感受，以及开展该研究工作重要意义的大会发言。并鼓励该领域的研究工作要有创新和原创力。 本次讨论会的中心议题是： 1、低氧生理学和高原医学研究的现状与展望 2、祖国西部大开发中低氧生理学和高原医学的作用 3、高原低氧的适应 4、高原低氧的效应 5、高原与低氧环境健康保护的医学对策 一、生理学和高原医学研究现状与展望 周兆年研究员作了题为“低氧生理学和高原医学研究的现状及展望”的主题评述报告，详细介绍了以下四方面内容：1）高原医学和低氧生理学发展的历史事件；2）学术会议和出版物情况；3）低氧生理学和高原医学的研究；4）对抗高原低氧的健康保护途径和措施。同时提出了该研究领域中的问题与展望。报告中提到，国内外低氧生理学和高原医学发展历史与经济增长，军事需要，科研和登山活动以及人民健康问题的要求密切相关。而低氧反应、适应和损伤机制研究对流行病学和经济学到基础生物学都具有根本性意义。近年国际上，低氧生理学与高原医学的学术活动相当活跃。每二年在加拿大定期召开一次国际低氧学术讨论会，今年举行了第十二届学术会议。自1994年由国际高山医学学会组织的每二年一届召开“世界高原医学与高原生理学会议”，1998年6月莫斯科举行第三届国际低氧医学学术会议，2001年在瑞士日内瓦将举行第四届会议。2002年西班牙巴塞罗那将举行第五届会议，国内已获青海省的支持争取2004年在中国青海西宁召开第六届会议。1996年由美国耶鲁大学医学院呼吸内科主任，细胞和分子生理学教授Gabriel G. Haddad负责主编长达1085页的《组织氧丧失 从分子到整体功能》（Tissue Oxygen Deprivation - From Molecular to Integrated Function）一书全面介绍近二十年来有关低氧研究的进展，充分说明低氧研究在生命科学领域中的重要地位。1997年由美国国立环境卫生研究所发起了投资6千万美元的科研计划促进环境基因组计划（EGP）的启动。环境基因组计划是实现弄清楚人类面临的环境与健康的内在关系。 我国是一个多山高原国家，仅青藏高原面积即约250万平方公里，占我国陆地面积的1/4强。青藏高原不仅是地学、生物学等学科研究的一个得天独厚的天然场所，而且也是我国有待开发的一块宝地，对我国的经济建设至关重要。青藏高原是空气少氧的生物地球化学区域，高山病是高原开发利用的障碍之一。高原和高山生理研究具有特别重要的意义。久居高原的藏族也是世界瞩目的我国特有民族，因此，低氧生理学和高原医学研究具有鲜明的中国特色，既有理论意义，又有实际应用价值。我国50年代初在进军西藏及建设川藏、青藏公路的同时开展了高山反应的最初观察工作，近20年来，青海、西藏、新疆高原地区的科研和医学单位以及中国科学院上海生理研究所、中国医学科学院基础医学研究所、军事医学科学院卫生学环境医学研究所、第三军医大学的广大科研人员在高原现场、实验室和临床实践等方面做了大量的低氧生理学和高原医学的研究工作。取得不少成绩，获得了很多国家和部委级的科技成果奖项。 国内外对于机体的低氧适应机制从分子水平、细胞水及组织水平进行了大量研究工作。与会专家们分别以“低氧适应相关基因与低氧应激反应”、“慢性高海拔低氧的细胞感受和分子适应”、“组织与细胞水平上高原适应机制”、“心肌低氧适应的信号传导”为题介绍了国内外研究结果。 “低氧适应相关基因与低氧应激反应”的专题发言中提出，低氧适应相关基因主要是指一类能够接受低氧信号调节，并参与低氧适应性反应的基因群。科学家们在对低氧适应机制执着探索中，对适应发生的生理和生物化学特点已获得了相当深刻的认识，并对其基因基础进行了多角度的探索研究。目前，对于世居高原人群与平原人群基因差异的研究尚未有突破性的发现。但在低氧适应性反应相关基因的探索中，已先后发现了以低氧诱导因子（HIF-1）、促红细胞生成素（EPO）和血管内皮细胞生长因子（VEGF）等为代表的低氧相关基因30余个；已经确认，在低氧条件下，这些基因的表达产物所产生的多重生物学效应与提高机体氧携带和氧运输效率，增强低氧条件下的糖代谢调控和应激反应能力密切相关，对于低氧适应生理学机制的建立具有明确而重要的意义。已有的研究结果提示,机体低氧适应机制的建立取决于对低氧应激反应能力。低氧应激反应的基因行为与获得适应的分子机制密切相关。将低氧应激反应相关基因作为切入点，从新的角度探寻低氧适应基因及其诱导调控机制，不仅有助于更深入认识低氧适应机制，而且可为有效预防高原低氧损伤医学措施的制定提供更直接的科学依据，促进低氧生理学和高原医学研究在祖国西部的开发建设中发挥积极作用。 在“心肌低氧适应的信号转导”的专题发言中指出，低氧或缺氧刺激经由配体-受体的相互作用，激活心肌细胞的信号传导通路，改变特异性的基因表达或稳定性，影响蛋白的翻译或降解速率，从而导致心脏生化和功能的改变以维持氧张力异常时的功能。大量的研究表明反复短暂的心肌低氧/缺血产生的适应反应，可使心脏在随后的长期低氧/缺血中得到明显保护（低氧/缺血预适应）。因此阐明低氧预适应心肌保护作用的机理，寻找诱导预适应的药物作用位点，是临床和基础研究者的共同兴趣点。近年来研究表明，蛋白激酶C(PKC)可能是心肌保护的关键信号传导通路。越来越多的证据提示PKC通路介导的心肌保护作用的 效应器之一为线粒体KATP通道(mitoKATP)。因而由PKC介导的mitoKATP通道的开放可能是低氧心肌保护作用的重要机理。目前国际上在低氧研究领域的热点为阐明细胞氧感受器，信号转导通路和寻找低氧适应基因。 专家们还介绍了颈动脉体、肾脏和肺血管平滑肌的氧感受器与急、慢性低氧条件下心血管功能、肺通气调节的关系，以及促红细胞生成素、血管内皮生长因子等基因表达在慢性低氧反应中的作用。 有位专家介绍，“高原人”大致可分为世居者（适应）和移居者（习服）。尽管已经认识到高原适应过程中存在着时间依赖性，但其确切适应机制仍不清楚。就氧在体内的代谢过程而言，氧通过肺部气体交换、血液氧和、血流运输，到达组织毛细胞血管，经弥散到组织间液，再到细胞，最后经线粒体摄取和利用。初入高原的早期，主要是通过呼吸、循环、血液系统的代偿性改变来达到提高供氧的目的，在对高原世居者及高原土生动物与移居者及平原动物的比较研究都已提示，机体对高原的根本适应则是通过组织与细胞水平对氧的高效利用，即“代谢适应”机制。然而，这方面的研究却所知甚少，“坚冰未凿，急待研究”。毛细血管密度是决定组织中氧弥散距离的重要因素。高原世居者和一些高原动物实验以及低压舱模拟高原实验都有关于心、脑、骨骼肌组织毛细胞管密度改变的报道，但结果似乎并不一致，难以总结出人们期望的规律。葡萄糖的酵解是缺氧时细胞提供能源的重要途径。几乎所有的体外实验均证实，缺氧时细胞无氧酵解能力增强，这与糖酵解酶的活性或/和表达量增高有关，但对于整体实验和高原世居者的代谢适应机制则研究不多。线粒体是机体氧传输的最后终点站，也是能量产生的主要场所，“线粒体适应”在高原适应中占有重要地位，线粒体的结构、功能和数目对机体在缺氧时能量的供给有很大影响。不少实验证实，长期高原暴露时组织线粒体数量增加，但也有数量并不改变的报道，这似乎与物种、组织差异等因素有关。 二、低氧生理学和高原医学在西部大开发中的意义 自从我国实施西部大开发战略以来，进入高原地区的人群与日俱增。最近，已宣告结束西藏不产原油的历史，在海拔4300米的高原上已发现储量上千万吨的油田，国务院已明确宣布新世纪加快青藏铁路等基础设施的建设。为保障高原建设者和世居高原人群的健康、边疆地区的经济发展、巩固国防、以及拓宽人类生存空间，研究高原低氧对机体的影响、低氧适应机制及低氧防护措施势在必行，这对顺利实施西部大开发具有重要的现实意义和深远的历史意义。同时，研究高原低氧对机体的影响，低氧适应机制及低氧防护措施，均对国计民生具有重要的现实意义，对心肺等疾患引起的缺氧症的防治也具有重要的理论意义和临床实际意义。青藏高原的特殊环境与人类低氧适应有着紧密联系，增加了开展低氧生理学和高原医学研究的特殊意义。 与会专家们认为，西部地区自然环境特点是高原低氧、旱寒，特别是高原低氧对人体的影响尤为突出。因此加速人体对西部地区低氧环境的适应、提高生存和劳动质量是西部大开发对高原医学和生理学研究的最重要需求。急需开展两方面工作，一是基础研究，揭示高原病发病机制和人体低氧适应的物质基础。二是应用研究，即高原病防治措施和加速人体适应低氧的致适应剂（药物、生物制品）的研究。因此高原医学和生理学研究的进展和突破对于顺利实施西部大开发有重要意义。另外，低氧是疾病发生发展中的最基本的病理过程，上述研究成果对于临床低氧性疾病的防治也有重要指导意义。高原医学是研究海拔3000米以上高原地区人群在低氧环境下的生理改变及由低氧所引起的高原病防治的一门学科。世界上很多发达国家出于各种目的（包括军事及太空探索）对低氧生理和高原病研究工作均十分重视，设立了相应的研究机构，并投入较多的经费及研究人员。可见，高原医学不仅仅是研究高原上居住的人口健康的一门科学，它与现代社会的经济、文化、旅游、国防等方面有着重要意义，也与人类未来利用地球上的生存空间等都有着长久战略意义。目前党中央实施西部大开发战略，西部诸多省区地处高原或拥有高原地区。因公务、商务、开发、旅游、宗教活动来往于高原地区的人与日俱增。近年统计表明，乘机来拉萨的人群中约35-80%患不同程度急性高原病，上高原的换防部队，往往因下机后患有不同程度急性高原病，使整个部队战斗力下降。而长期居住高原的人又面临慢性高原病的危害，如西藏藏北当地牧民患慢性高原病者约占33%，当地汉藏职工患病率高于当地牧民，严重影响当地资源的开发利用，很多开发者闻而畏之。因此高原医学显得日愈重要，需加强高原医学现场实践研究。 专家们认为高山低氧生理学和高原医学是一个“广泛的生物学”问题。要抓两头：“既要重视高原疾病治疗、又要注重基础研究”，不解决基础问题不行！今天我们有很好的形势，要集中优势，组织力量、分工合作。争取国家的支持，把此项工作搞好。 三、高原低氧的适应 机体对高原低氧的反应是整体的综合效应，既有系统器官、组织水平上的，也有细胞和分子水平方面的变化。低氧生理反应是多种多样的，最明显变化是过度通气（hyperventilation）、红细胞增多（Polycythemia）和呼吸性硷中毒（alkalosis），但细胞和代谢改变更为重要。随着分子生物学发展，低氧作用下的蛋白质、基因变化日益受到重视。现采用不同的先进技术，如核磁共振谱，膜片箝、激光共聚焦显微镜和细胞流式仪等，从整体、细胞、到分子水平上开展研究。机体进入高原低氧环境，随时间持续程度，为了代谢过程需要，低氧反应使通气增加，心血管系统功能增强，加速氧传递到组织。组织水平的改变允许摄取更多氧，更有效地利用氧。最近国际研究集中在上述这些变化如何由基因表达的改变来调控的。整个研究从整体系统水平和各器官的分子和基因水平的有机结合，以阐明低氧习服和适应的效应和机理。 有一位专家在 “神经肽与高原低氧”报告中指出，高原低氧以一种非特异性因子，作用于机体的各个水平，引起应激反应、演化成适应或导致疾病。神经肽及其受体与基因，在高原低氧生理和疾病发生发展过程中起着极为重要的作用。高原低氧对下丘脑神经肽的作用及神经肽参与低氧免疫功能的调节。低氧刺激下丘脑CRF分泌，激活下丘脑—垂体—肾上腺轴（HPA）功能，继而增强垂体ACTH和肾上腺皮质酮（B）的分泌。高原低氧抑制细胞免疫和体液免疫。神经肽及其受体不仅控制着基本生命过程，而且调节高级行为活动。因而倍受重视并取得了许多重大成就。在高原低氧生理学与医学的研究中，应重视神经肽及其受体与功能基因组在低氧应激与演化适应中所起的作用和意义，阐明低氧作用分子机制和整合理论，研究发展基因分子介入药物，促进高原地区社会发展与经济繁荣。 有的专家提出，高原适应是指机体对高原低氧环境产生良好整体功能的全面适应，而且作为生物学性状固定下来，经过遗传机制传给子孙后代。研究发现，居住高原历史久远者比居住历史短者具有更好的适应性。藏族是世界上居住高原时间最长，相对比较封闭，对高原的适应能力最强的民族，他们对高原的适应最能体现自然选择的作用，这种作用必然在基因水平上得以表现。藏族人对高原的适应是多层次、多环节上的适应，这种良好的适应能力可能是多种相关基因调控的结果。为此，充分利用我国独特的遗传资源优势，积极研究这些参与高原适应的相关基因及其作用机制，不仅具有重大的科学价值，而且具有广泛的应用前景，必将对我国的国民经济和科学发展起到巨大的推动作用。 有一位教授“从藏族生理看人类低氧适应的生物学模式”的报告中提出，高原医学的研究核心是低氧适应，而对高原不适应所带来的问题诸如高原劳动力受限、高原病和高原衰退等都离不开这一中心。报告主要讨论了三个问题：1）高原习服（acclimatization）和适应（adaptation）的概念；2）生命早期获得适应； 3）高原适应的整体观。习服是机体发生的一种可逆的非遗传性的形态和生理变化，使之能生存于一个外异的环境。而适应是有遗传学基础可以遗传，并发展为具有生化、生理和解剖特征，使之能在高原环境达到最佳境地。研究证明，高原世居藏族已对高原产生有效适应。人类对高原的适应是从受精卵开始的瞬间即开始了的，尽管对此所知甚少，但藏族已建立起完善的母体-胎盘-胎儿系统（The maternal-placental-fetal system）及适应低氧的胎盘机制（placental mechanism）。目前已证明藏族胎循环血量比移居汉族胎儿更充分。藏族婴幼儿肺小动脉肌层较薄则是这一宫内适应的印记。机体对高原整体水平的适应体现在器官水平、组织水平和分子水平，以上三个水平的适应是相互作用，相互影响和相互协调的，在神经体液的统一调控下，达到整体的综合适应。藏族低氧生理为人类高原适应提供了一个理想的生物学模式，这是长期高原居住历史经过自然选择而获得“遗传适应”（genetic adaptation）的结果。但是，高原适应是一个极其复杂的生物学问题，当今我们仅仅是拉开了序幕，21世纪高原生命医学科学将更加丰富多彩。 专家介绍，低氧反应存在个体差异和种族群体差异性，低氧对机体影响，不仅取决于低氧程度和持续时间，也取决于机体反应性。机体对低氧反应存在着明显之种族差异性。不同人群沿同一途径和同样上升速度其急性高山病（AMS）发病率不全相同，而且还存在着急性AMS易感者。上海生理所提出AMS敏感者低氧通气反应明显低于正常人。 参会人员名单： 刘东生 院士 中科院地质与地球物理所 周兆年 研究员 中科院上海生命科学院 吴天一 教授 青海高原医学研究所 吕永达 研究员 军事医学科学院 赵芳玲 副主任医师 武警海南省边防总队医院 郭学勤 教授 上海医科大学 高天明 教授 广州市第一军医大学 宁学寒 教授 美国 石中瑗 研究员 上海交通大学 梁培基 副研 中科院上海生理所 谢新民 副教授 青海医学院 吕国蔚 教授 北京首都医科大学 薛全福 教授 中国医学科学院 蔡英年 研究员 中国医学科学院 邓希贤 研究员 中国医学科学院 齐保申 副研 中国医学科学院 李 强 研究员 北京体育科学研究所 王福庄 研究员 军事医学科学院 范 明 研究员 军事医学科学院 杨黄恬 研究员 中科院上海生命科学院 钱令嘉 研究员 军事医学科学院 谢增柱 教授 重庆市第三军医大学 高钰琪 教授 重庆市第三军医大学 柳君泽 研究员 重庆第三军医大学 格日力 博士 美国 夏敬生 博士后 中科院上海生理所 吴秀凤 实验师 中科院上海生命科学院 杜继曾 教授 浙江大学 岑维浚 主任医师 西藏高山病心血管病所 平措扎西 主治医师 西藏高山病心血管病所 王迪浔 研究员 华中科技大学 雷志平 教授 西安体育学院 王锡岗 教授 台湾阳明大学 冯文龙 副教授 香港大学医学院 王锡五 副教授 台湾长庚大学 陈朝峰 教授 台湾大学 曾宪英 研究员 上海市海军医学研究所 丁江舟 副研 上海市海军医学研究所 盛民立 教授 上海医科大学 冯雪莲 研究员 国家自然科学基金委 韩存志 研究员 香山科学会议低氧对大脑神经的影响 　　　2001-03-26 15:20:17　　来源:??李舒平（山美天地） 　 低氧对大脑神经的影响： 大脑完全缺氧的情况下，一般三分钟到五分钟，缺氧对大脑造成的损害不可逆转。到8分钟时，大脑细胞大量坏死。 严重缺氧，即不完全断氧，如雪崩的情况人的周围会有少量空气残留，这种情况30分钟左右，损伤就是不可逆的。小脑的存活时间长一些，长5分钟~6分钟，延髓的存活还能延长十几分钟。 在7000-8000米，动脉血氧饱和度为69%时，出现动作错误，64%时，出现震颤，56%时，临界意识不清，8000米时，为56%，意识模糊。 这些数据来自于人工实验室，在减压舱里得到，机器测出来的，数据比较死，反应不出个体的差异。由于人体适应性能力存在差异，还由于减压舱里高度急性上升，在一个高度停留的时间不超过半小时，通常是减压减到1000米的高度，然后做实验测数据，过了半小时，继续减压到2000米~3000米，就这么上到8000米高度。实验室的极限缺氧，和登山不一样，登山是一个很慢的逐步适应的过程。所以我们既要要尊重科学，但也要看实际。王富洲他们三个人60年5月24号登上珠峰，从8830-8848高差14米，路程40~50米，一共用4多个小时才爬上去，再从顶峰回来，回到8800米，共用了6个多小时，他们一点氧气没有，还能顺利回来，也没有什么大问题。 曾经有一个登山者在低压舱里做实验，上到9120米，停留30分钟，肺泡里氧分压降到31毫米汞柱。比8000米的平均值还高一点，他很清醒，又上到1万米，肺泡里氧分压降到24个毫米汞柱。他还是清醒的，只是活动缓慢一点。 差的人在昆明1800多米就有高山的反应，大部分人在3000米开始有高山反应。 7000米以上曾经被认为是高山死亡带，现在一般认为是8千米，从理论上讲人类无法生存，但不一定马上会死，呆长了才会死。如果有人在珠峰峰顶，呆上一周，肯定下不来。5800米是英国的生理学家和登山家Pugh根据自己体会定出的，他的登山营地设在5790米，他认为在这里能做到完全代偿。我们从生理测试的各个综合因素的数据来看，觉得5500是个界限。由于他本人既是生理学的专家，又是登山的专家，国际上认可了这个数据，把5800米作为人类身体可以完全代偿的一个限度，当然这是根据实践经验估算出来的。 3000米以上称高原地带，3000米以下算平原地带，5800米以上为特高海拔，5800米以上是人类长期生存极限。 6000米是高等植物生长极限，7000米是陆地动物的生长极限，7000米以上无陆地生物。 强烈太阳辐射的影响 太阳辐射影响我们健康的主要是紫外线 紫外线有长波，中波、短波，波长越短对人体损害越大。高原地区，一是由于海拔高，紫外线很强烈，海拔每升高100米高度，紫外线辐射增加1.3%左右，在增加的太阳辐射里面，短波紫外线的增加对我们的影响会更大。 二是由于空气稀薄，透明度高，对紫外线辐射阻挡小。 三是由于日照时间长。四是由于冰雪的反射率高(平均反射率70%，新降雪80%，亮冰90%以上)。在高山上，一见了雪，必须马上戴太阳镜。我们93年和台湾队员一起登珠穆朗玛，其中一个队员是户外专家，经常带大家去登山，偏偏就是他自己得了雪盲，因为他是近视眼，用的是套的墨镜片，只带了一副，在山上摔了一跤就没了。他说是进了砂子，眼红，风一吹，又是疼，又是流眼泪。其实这就是雪盲，雪盲的症状之一就是像眼睛里揉进了沙子。 所以大家要牢记住，见了雪必戴眼镜。尽管雪盲没有后遗症，但会影响本次登山。有经验的登山者，都有备用眼镜，以防万一，宁可多带一点，累一点，也不要因此上不了山，白来一趟。 这个表上的紫外线的强度，是倍数比较。在武汉海拔23米，基本为平原。以之为1，珠峰大本营的短波紫外线则为13倍；以大本营为1，9000米则为1.67倍，非常厉害，除了雪盲以外，还能引发口唇疱疹，日光性皮炎等，并对整个机体的适应能力和适应状态都有影响。 低温的影响 在高原上，高度每升高100米，气温平均降低0.56度，而且高原地区，温差很大。 人的体温降到35度时，整个处于低温状态，所有生命器官，包括心、肺、肝等器官，温度降到25度时，不能进行新陈代谢，心脏停博。此时，呼吸还会有一点。但假如时间短，还有可能救治。 风的影响 一个是压力（推力）的影响，表现在增加体力消耗，使登山者很累，体力消耗很大，花很大力气克服风阻力。另一个方面和温度有关系。我们实际感受到的体温，主要取决于气温同时受到风速很大的影响风可以迅速散热，体表实际温度急剧下降，我们所见的冻伤里面有很大一部分，不仅因为室外温度低，而是因为风大。65年在珠峰训练的时候，风很大，人就象放在低温实验室快速降温，你能看着没有保护的鼻子迅速发白，发青，发黑，非常快，就跟实验室里就把兔子脚放在液氮里类似。登山冻伤防护上很重要的一点是避风，不能被直吹，要戴围巾，帽子，手套等等防风。另外，遇到大风，要会躲避，藏到安全处，实在找不到，也要背对风。实际温度等于实际的 气温加上系数乘上风速，和风的关系很密切。 风速最大级是12级，29米/秒以上就是12级（风的分级一共只有12级）。珠峰的顶峰风很大，在8100米大风能把人和帐篷吹走。珠峰地区一年平均风速是50米/秒，夏季15米/秒，冬季45米/秒，最大为105米/秒，春季20-30米/秒。 湿度的影响 湿度随高度增高而减少，越往上走越干燥，到4000米，相当于海平面湿度的17%，到了6000米相当于海平面5%，到了8000米是1%，非常干燥，人会觉得很难受，。 雷暴的影响 新疆地区电离活动比较多，那里的登山者身上的金属物会闪闪发光，就是电离感应的作用。在纬度较低的西藏，雷暴不常发生。 以上我介绍了高山环境特点，作为认识高山病的背景知识。 　第二个问题，谈一谈高山病的发病原因和机制。高山病主要病因是缺氧，其它原因较次。氧是人类生存和发育成长基本条件之一，所以高山缺氧势必会造成人体各种功能障碍，结构的损害，从而产生各种疾病。 在缺氧条件下，人体以增加摄氧量和细胞的供氧量，同时以组织细胞提高利用氧的能力，来克服和减少缺氧带来的伤害，也就是机体对缺氧产生了适应能力。缺氧的程度加重，超过体能限度，就会产生高山病。高山病的发病过程，也就是适应与不适应此消彼长的发展过程，也就是环境缺氧和人体抗缺氧能力之间，从不平衡到平衡，再进入新的不平衡，最后建立最脆弱的新平衡。只要缺氧程度不断加重，最后一定会发生高山病。 缺氧对机体的影响，综合的作用主要表现在能量代谢。人体的能量的产生，是由各种营养物质转为糖，进入循环，最终进入各种细胞、化为ATP，供给人体使用。糖代谢本身是有氧反应，所以在缺氧情况下，会造成ATP的缺乏，会造成能量不足，细胞会病变，坏死。 大脑缺氧的早期，轻度情况下，人处于兴奋状态，我们经常可以登山时看到，有些平常比较腼腆的人到山上变得很大胆，话也敢说了，事也敢做了，原来很谦虚的人在山上可以变得很狂妄了，很会吹牛，在某种情况下，缺氧会导致心理变化，大脑皮层处于一种兴奋状态，人表现的张扬亢奋。然后，如果缺氧进一步加重，大脑皮层受到抑制，这时人比较郁闷，很受压制（听众大笑），沉默寡言更严重，还会有幻听，幻视。有个登山队员，75年为了完成任务，尽管他适应并不好，还是坚持到了8000米时。以前他在这个高度上出现过幻视，看到了喇嘛庙，后来他因滑坠牺牲。另外人走路不太稳，自控能力比较低，在高山上，登山运动员较易发生争吵。还可能变得很固执，一意孤行。人到那份上，自己都不知自己怎么回事了。严庚华同志登珠峰，当时他的压力很大，多少人劝他不要再登了，他都不听。他就非要登。因为电视台都准备好了，再要电视台准备一次，那是很困难的。他以前没到过那么高的地方，适应不良，高山反应可能是他牺牲的因素之一。 人在缺氧时，判断能力不是很准确，会有意识朦胧，模糊，一直到晕厥。 缺氧对心脏也产生影响，心率每分钟增加20-40次，人就比较难受。如果心动过速持续1-2天，就应-该下撤。缺氧会使心脏肥大，血压变高，血细胞增加。血细胞增加的好处在于增加了运货车辆，但运的东西少了。血细胞增多可以提高运动员的有氧运动耐力，但同时血液稠度增加，血栓发生率变高。 这种效应是高度缺氧产生，也就是EPO刺激产生的。 血红蛋白在高原20克正常，登山运动员会达到27克。 对血液驯化和组织供氧产生很大的影响。缺氧会影响消化，胃蠕动变慢，人不想吃东西。 并且将影响微循环，由于氧和营养要经过微循环才能供身体各部分使用。如果微循环有问题，人体的能量供应会产生不足。 缺氧对内分泌的影响，使人体内环境发生变化。 会影响泌尿系统，阻碍水和Na的排出。另外由于内分泌的影响是全身性的，所以缺氧的影响广泛而弥散。 低氧也是冻伤，雪盲易发生的原因。 第三个问题：高山并的防治这张表是登山事故，死亡原因比较表 第一位滑坠，二雪崩，三高山病，因此我们对高山病给予足够重视。 高山病使队员提前出山，造成减员。它也是滑坠的原因，由于高山反应体力不支，走路不隐，意识不清，是滑坠的重要原因。 表2 慢性高山病和我们来讲问题不太大，主要对长期在高山工作的人来说，更重要一些，一般6个月以上停留高原才可能发生慢性高山病，平原人长期在高原上生活，才有慢性高山病。我们登山一般最多长三个月，不至于发生这个问题，所以这里只讲急性病，这些急性病经过治疗，休养，基本能恢复，不会留下后遗症。 第一个就是急性高山反应，这是最常见的，这个表统计在3350-5500米之间的1925人中有800多人发生高山病，有240多人在3天内渐渐恢复，随着停留时间延长，完全活的很快乐的越来越少，大多数比较痛苦 。 一般来讲，急性高山反应在6-12小时发病，大部分十几个小时后发病，最长的24小时后发病，一般在三天以内恢复，最长的人14天以后才慢慢恢复。 主要表现：5900米以上，轻度反应100%（包括藏族在内），大家都有，不分藏汉，一律平等。 较重的反应，如浮肿，全身无力，精神不佳，眼睛浮肿，显然汉族多。随着海拔高度增加，人数越来越多。主要症状是头痛、头昏、睡眠不佳、全身无力、食欲不好、浮肿等几种反应。 急性高山反应的预防： 高山病的诱因关键是缺氧。 有些病可以预防，因为它和到达高度，上升速度有明确关系，因此上高原要慢慢上。它也和个体适应能力有关。在进山前进行体能训练，做有氧运动，（主要是耐力性项目），长跑、游泳等等，很有用处。高山反应的严重程度，恢复快慢和整体素质有关系，有一个很大忌讳就是上山前不要得大病，尤其伤风感冒正在流鼻涕擦眼泪，不要上，这是不太安全。 高山反应和心理因素有关，有人出问题，心理紧张，身体没有什么不好。进山以前，听了很多传闻，过唐古拉山口时不知道已经到了，没出问题。过了以后，有人开玩笑说到了，他就马上不行了，这其实是紧张状态下的生理反应。 药物预防。 国家登山队基本上不用。因为药物掩蔽了人体的正常反应和恢复，如果掩盖了问题，我认为反而不好，不主张用药。 如果实在要用，药物有两种比较可靠。复方党参片，进高原之前两天开始服用，每天8片，减少高山反应的效率为80%。，部队上销量很大，由于一般平原用不上，药店里没有这药。 另一种药片也有效，醋氮酰胺，本质上一种缓和的利尿药，是磺胺类药，在国外用较多，英文名Diamox。进山前一到二天开始用，每12小时服一次，一次250毫克，上高原后继续服用，共服药3-4天停。 治疗问题： 1、扛着，等着机体适应，如果适应不了就回家，不要硬撑。 2、对症治疗，头病医头，脚痛医脚，让病人感觉舒服一点。 头痛就用一般止痛片就很有效，又简单 ，又好买，又管事。对胃刺激小。阿斯匹林也行，但对胃刺激大，总之： 止痛的药就可以用。 血压高，用降压灵（治早期高压的药），再用一点利尿片，小剂量。浮肿：受重力影响比较大的部位，如眼睑，下肢易浮肿。我们75年那时比较辛苦，生活条件差，陪同的战士更差，还要负责警卫，建营等等艰苦劳动。战士知识水平低，浮肿得很厉害也不知道找人，我们的运动员浮肿也不少，有眼皮的，有小腿前侧一按一个坑的。比较浅的坑，是轻度浮肿，不要紧，用氨茶碱，有利尿和扩张血管作用，效果不错。100毫克一片，一片就行，一天1到3片。肿的程度严重，可以用双氢克尿塞，25毫克1片，一片就行了，剂量要小，因为是高山反应是正常反应，而速尿片副作用较大。 3、急性脑水肿，急性脑昏迷是比较严重的问题，会威胁生命。 它是由于细胞水纳滞留，细胞内水肿和细胞间隙水肿（从血管里渗出的水份增加）两种造成的脑水肿 治疗：1、吸氧，一般的高山反应一分钟氧气流量用1-2升就可以了，脑水肿则要用3-6升氧。吸氧，颅内压很快下降，头痛，恶心的症状也会几乎消失。 2、脱水治疗。主要口服药，用速尿片，40-80毫克，一天服3次左右，一天总量不要超过180毫克，在利尿的同时注意补钾，利尿时把大量钾排出去了，人体比较衰弱，而且电解质不平衡以后，，心脏等部位容易出现毛病，要吃水果或补充钾盐KCL。 直接作用血脑屏障的药物，50%高分子葡萄糖注射，20-60毫升，甘露醇，（降颅压的药），250毫升 ，一天二次 。还有地塞米松，低分子右旋糖酐等。要控制剂量，计算补充程度，还要加钾、ATP等，这个方法要由医生使用。谢谢你，很好。有没有关于缺血或缺氧与肺部疾患的文章？野生型p53、bcl2基因在低氧性肺动脉高压大鼠肺内表达及其分布中国应用生理学杂志 2000年第3期第16卷 研究论文作者：李荣　别毕华　彭则　张珍祥单位：同济医科大学附属同济医院呼吸病研究室，武汉　430030关键词：缺氧；高血压；肺；bcl2；P53　　摘要 目的：探讨野生型p53、bcl2基因在慢性低氧性肺动脉高压中 的作用。方法：建立慢性低氧性肺动脉高压大鼠模型，用原位杂交的方法 观察p53 mRNA、bcl2 mRNA在大鼠心脏及肺组织的表达和分布。结果：缺氧组大鼠肺小动脉壁厚度占血管外径的百分比(MT%)29.3%±4.5%明显高于正常对照 组15.2%±3.2%(P＜0.01)，肺小动脉壁p53 mRNA表达0.68±0.12明显弱于对 照组1.12±0.38(P＜0.01)，而bcl2 mRNA表达2.38±1.04强于对照组1.09±0.3 2(P＜0.01)。结论：①慢性缺氧能导致肺小动脉重建及肺动脉高压；② 野生型p53 bcl2基因均参与了慢性低氧性肺动脉高压肺血管重建的调控。　　中图分类号：　R543.2；　Q786文献标识码：A文章编号 ：1000-6834(2000)03-0246-04eXPRESSION AND DISTRIBUTION OF p53 AND BCL2 IN THE LUNG TISSUE OF RATS WITH CHRONIC HYPOXIC PULMONARY HYPERTENSIONLI Rong,BIE Bi-hua,PENG Ze,et al.　　(Respiratory Disease Ressarch Laboratory,Department of medicine,T ongji Hospital,Tongji medical university,Wuhan 430030)　　ABSTRACT　　Aim:To evaluate the role of p53 and bcl2 in the development of h ypoxic pulmonary hypertension.Methods:Rat models with chronic hy poxia induced pulmonary hypertension were established.Expression and distrbution of p53 mRNA and bcl2 mRNA in the rat lung tissue and heart were detec te d with in situ hybridization.Results:The ratio of the thickness of p ulmonary arteriolar wall to external diameter of pulmonary arterioles (MT%) was (29.3%±4.5%)in rats exposed to hypoxia for 3 weeks.It was significantly higher than those in normal control group (15.2%±3.2,P＜0.01).The expression of p53 mRNA in the wall of pulmonary arterioles in hypoxic rats was weaker (0.68 ±0.12) than that of control group (1.12±0.38,P＜0.01),but the expression of bcl2 mRNA in the wall of pulmonary arterioles in hypoxic rats was stronger (2 .38±1.04) than that of control group (1.09±0.32,P＜0.01).Conclusion:①Hypoxia can induce formation of pulmonary hypertension and structural reure remodeling of pulmonary arteriols in chronic hypoxic pulmonary hypertensio n.②p53 and bcl2 amy modulate the structure remodeling of pulmomary ar terioles in chronic hypoxic pulmonary hypertension.　　KEY WORDS:　anoxia;　hypertension;　pulmonary;　p53;　 bcl2　　野生型p53基因与bcl2基因广泛存在于全身各组织中，p53基因具有促进细胞 凋亡的作用，bcl2基因具有抑制细胞凋亡的作用，它们均为细胞凋亡重要的调控基因。它 们在其它组织器官的作用已有报道，在慢性缺氧动物心、肺组织中的研究尚未见报道。我们 通过观察野生型p53 mRNA及bcl2 mRNA在缺氧性肺动脉高压大鼠心、肺组织中的表 达，旨在了解野生型p53、bcl2基因在缺氧性肺动脉高压心、肺组织中的作用。　　1　材料与方法　　1.1　动物和缺氧　　雄性Wistar大鼠30只(同济医大实验动物中心提供)，体重180～200 g,随机分为对照组(n =15)和实验组(n=15)。实验组在常压条件下进行间歇性缺氧，每天8 h，连续21 d， 缺氧时将大鼠置于有机玻璃舱内，舱内浓度由测氧仪监测(Atom 日本产)。通过充入氮气稀 释，使氧浓度维持10%左右，舱内二氧化碳由钠石灰吸收，水蒸气由硅胶吸收，对照组不接 受任何处理，置于同一实验室饲养。　　1.2　血流动力学检测　　大鼠用1%戊巴比妥钠50 mg/kg腹腔内注射，麻醉固定，维持呼吸循环生命体征稳定，暴露右 侧颈外静脉，经颈外静脉插入一硅胶管经右心房、右心室至肺动脉，导管另一端经一压力传 感器(p23ID美国)连接四道生理记录仪(Nihon kohden)测定平均肺动脉压(mPA P)，以阻抗微分图测量心输出量(CO)。　　1.3　脏器湿重的检测　　肺脏：取除气管外的整个肺组织，称其湿重，比较两组的变化。心脏：剪取右心室游离壁(R V)及左室(LV)加室间隔(S)，分别称其湿重，计算出RV(LV+S)比值，比较两组的变化。　　1.4　组织标本制备　　右心与右肺组织标本用4%多聚甲醛(其中DEPC浓度为0.1%)固定，取右心和右肺石蜡包埋， 连续切片，作HE染色和原位杂交。　　1.5　原位杂交　　1.5.1　探针标记　野生型p53互补脱氧核糖核酸(cDNA)探针，bcl 2互补脱氧核糖核酸(cDNA)探针(购自武汉博士德公司)，地高辛随机引物标记和检测试剂盒( 购自德国Broehringer mannheim公司)1 μg cDNA探针，变性后加入六聚核苷酸混和物2 μl ,脱氧核糖核苷三磷酸(dNTP)标记用混和物2 μl，无菌水19 μl,DNA聚合酶Ⅱ大片段1 μl, 37℃ 20 h。以乙二胺四乙酸(EDTA)终止反应。加入2 μl 4 mol/L的氯化锂和75 μl预冷的 无水乙醇沉淀，20 μl TE溶解含用。　　1.5.2　杂交前预处理　石蜡切片常规脱蜡，0.2 mol/L盐酸20 mol,0.1% DEPC,0.01 mol/L PBS各洗2次，每次3 min,蛋白酶K 1 μg/ml 37℃消化15 min,0.2%甘氨酸 ，0.01 mol/LPBS，0.1